Diseñado para estudiar linajes de astrocitos en ratón, Star Track permite marcar distintos clones de astrocitos o células NG2 con una combinación específica de proteínas fluorescentes. Este método se basa en la electroporación in utero de una mezcla de 13 plásmidos. Esta mezcla está formada por 6 plásmidos, cada uno con un promotor GFAP (marcador de astrocitos con expresión débil en células NG2) que regula la expresión citoplásmica de una proteína fluorescente, y otros 6 para la expresión nuclear. Debido a que la marca que se genera tiene que ser estable y no diluirse con las divisiones celulares, estos plásmidos también contienen las secuencias del transposón Piggybac. Además, la mezcla de plásmido también incluye un plásmido que codifica ubicuamente para la transposasa Piggybac y promueve la integración del resto de plásmidos.
Bulbo olfativo de ratón marcado con Star Track.
Una vez electroporada la mezcla de los 13 plásmidos en el ventrículo de embriones o postnatales, los progenitores que rodean el ventrículo adquieren la mayoría de los plásmidos. Sin embargo, por azar, solamente se integrarán algunos de estos plásmidos y por tanto el progenitor contendrá una combinación específica de los 12 plásmidos. Debido a la integración en el genoma mediada por el transposón Piggybac, toda la progenie derivada del mismo progenitor heredará la misma combinación de proteínas fluorescentes. De este modo, los clones de astrocitos o células NG2 mostrarán un color único en el citoplasma y núcleo, que sirve para resolver los distintos linajes.
Distintos tipos celulares pueden definirse en función de la expresión de una combinación específica de genes marcadores. Por tanto, si se quiere ganar acceso genético a un tipo celular concreto, una de las vías implica dirigir la manipulación genética a aquellas células que expresen una combinación de marcadores genéticos a través de métodos de intersección genética. El problema es que estos métodos normalmente solo consiguen una intersección de dos marcadores genéticos.
CaSSA surge como alternativa a las intersecciones genéticas clásicas con recombinasas u otras herramientas de biología molecular. Esta herramienta se basa en dos elementos esenciales: 1) CRISPR/Cas9, una endonucleasa que corta DNA en aquella región de 20 pares de bases codificada por un gRNA, y 2) Single Strand Annealing (SSA), un mecanismo evolutivamente conservado para la reparación de regiones de DNA con repeticiones. En CaSSA, el gen a expresar (por ejemplo, reporteros como el GFP o efectores como una recombinasa), se interrumpe por varias regiones de activación. Estas regiones consisten de dos repeticiones directas de una parte del gen, separadas por una o múltiples secuencias reconocidas por un gRNA específico. Debido a que el gRNA codifica una secuencia de 20 pares de bases, se puede diseñar un número casi ilimitado de gRNAs específicos y por tanto de regiones de activación distintas. Cuando un gRNA específico reconoce la región activadora en presencia de Cas9, esta enzima corta el DNA. Este corte induce la reparación por SSA, que resulta en la eliminación de una de las repeticiones y de la región reconocida por el gRNA, reconstituyendo así la secuencia original del gen a expresar en esa región.
Hasta ahora, la mayor parte de trabajos de análisis de linaje han implicado el marcaje de clones de células procedentes del mismo progenitor. Sin embargo, este análisis no permite ver la estructura del árbol de linaje, ni saber qué células se han generado en las primeras divisiones y cuáles en las últimas. Existen alternativas que permiten ver la estructura del linaje, como son ciertas herramientas que trazan las mutaciones espontáneas o inducidas que ocurren en el DNA a lo largo del desarrollo. Sin embargo, estas herramientas acaban con la estructura y la morfología de las células, no permiten seguir el linaje con alta resolución y tienen un coste muy alto.
CLADES se ideó como una alternativa que permitiera marcar células procedentes del mismo linaje y que se hayan generado a tiempos distintos con distintas combinaciones de colores de manera predecible, y así poder seguirlas con microscopía confocal sin necesidad de disgregar el tejido. Esta herramienta se basa en CaSSA y permite diseñas gRNAs que son activables por otro gRNA. Esto permite crear una cascada de activación de gRNAs. Cada gRNA en la cascada, a su vez controla la activación o desactivación de un reportero fluorescente. Cuando CLADES se activa en un progenitor, su progenie va heredando la combinación de colores que el progenitor estaba expresando en el momento de la mitosis. Como la secuencia de combinación de colores es predecible y se programa de antemano, la combinación concreta heredada por la célula permite predecir el orden en el que las distintas células se han generado.
Esta herramienta se ha optimizado en Drosophila y ha permitido confirmar el orden en el que se producen las neuronas de ciertos linajes concretos. Su funcionamiento es tan sencillo que permitirá trazar linajes a nivel de célula única en poco tiempo. Esto también permitirá analizar fenotipos de mutantes en los que el linaje se vea alterado.